CRISPR Nedir? Gen Düzenleme Sistemi Nasıl Çalışır?

CRISPR’ın tanımı ve temel kullanım amacı

CRISPR adı, prokaryotların yani bakteriler ve arkeler gibi çekirdeksiz hücreli canlıların genomlarında bulunan, aralıklı kısa ve tekrarlanan DNA dizilerini ifade eder. Bu dizilerin arasındaki bölümlerde, daha önce hücreyi enfekte etmiş virüslerin, özellikle bakteriyofajların DNA parçalarından türemiş diziler bulunabilir. Böylece CRISPR bölgesi, hücrenin daha önce karşılaştığı yabancı genetik materyale ilişkin bir kayıt taşır.

Gen düzenleme teknolojisinde ise bu doğal düzenek yeniden tasarlanarak belirli bir DNA bölgesine yönlendirilir. Rehber RNA, hedef DNA’daki tamamlayıcı diziyi bulur; ona bağlı Cas proteini de hedef bölgede kesim yapar. Hücre kesilen DNA’yı onarırken dizide küçük bir değişiklik oluşabilir veya araştırmacının yönlendirdiği bir değişiklik ortaya çıkabilir. Bu nedenle CRISPR’ın temel kullanım amacı, genlerin işlevini incelemek, biyoteknolojik ürünlerin geliştirilmesine katkı sağlamak ve bazı hastalıkların araştırılmasında kullanılabilecek genetik değişiklikleri denemektir.

Örneğin bir araştırmacı, belirli bir genin hücredeki görevini anlamak istiyorsa o genin DNA’sına karşılık gelen bir rehber RNA hazırlayabilir. Cas proteini bu bölgeye yönlendirilip DNA’yı kestiğinde, hücrenin onarımı genin çalışma biçimini değiştirebilir. Araştırmacı daha sonra bu değişikliğin hücre davranışı üzerindeki etkisini inceleyebilir. Burada CRISPR’ın yaptığı iş, tek başına “yeni geni yazmak” değil; seçilmiş DNA bölgesinde hücresel onarımın başlayacağı bir kesim oluşturmaktır.

Doğal bağışıklık sistemi olarak CRISPR’ın kökeni

CRISPR sistemi, bakterilerde ve arkelerde kendilerine saldıran yabancı genetik materyale karşı çalışan bir savunma mekanizmasıdır. Bir bakteriyofaj hücreyi enfekte ettiğinde, faj DNA’sından alınan bir parça CRISPR bölgesine yeni bir aralık dizisi, yani spacer olarak eklenebilir. Bu kayıt daha sonra RNA’ya aktarılır ve benzer bir yabancı DNA yeniden hücreye girdiğinde tanıma için kullanılır. Cas1 ve Cas2 gibi proteinler, yabancı DNA parçasının CRISPR dizisine eklenmesiyle ilişkili görevler üstlenir.

Bu mekanizma edinilmiş bağışıklığa benzer: Hücre, önceki karşılaşmadan kalan moleküler bilgiyi sonraki enfeksiyonlarda kullanır. CRISPR bölgesinden üretilen küçük CRISPR RNA’sı, Cas proteinlerine hedefin hangi dizi olduğunu bildirir. RNA ile yabancı DNA arasında yeterli eşleşme olduğunda savunma kompleksi yabancı materyali parçalayabilir. Örneğin daha önce belirli bir fajla karşılaşmış bir bakteri, o fajdan alınmış diziye sahip yeni bir CRISPR kaydı taşıyorsa sonraki saldırıda benzer DNA’yı tanıma ve yok etme olasılığı kazanır.

Cas proteini, rehber RNA ve hedef DNA arasındaki ilişki

CRISPR gen düzenleme sisteminde üç temel unsur birlikte çalışır: Cas proteini, rehber RNA ve hedef DNA. Cas proteini, DNA üzerinde kesim yapabilen bir enzimdir. Rehber RNA ise Cas proteinine hangi DNA bölgesine yönelmesi gerektiğini gösteren nükleik asit parçasıdır. Hedef DNA, rehber RNA’nın dizisiyle eşleşebilen ve bu nedenle düzenlenmek üzere seçilen bölgedir.

Rehber RNA ile hedef DNA’nın belirli bölümü arasında baz eşleşmesi oluştuğunda RNA, Cas proteinini doğru konuma taşır. Bu ilişkiyi bir adres sistemi gibi düşünebiliriz; adresi belirleyen rehber RNA’dır, DNA’da kimyasal kesimi gerçekleştiren araç ise Cas proteinidir. Doğal sistemlerde CRISPR dizisinden üretilen crRNA, Cas proteinleriyle bir kompleks oluşturur. Cas9 kullanılan tip II sistemlerinde rehberlik için crRNA ile birlikte tracrRNA’nın işlevi bulunur; gen düzenleme uygulamalarında bu iki RNA’nın işlevleri tek bir rehber RNA içinde birleştirilebilir.

Örneğin hedef DNA’sı “G-A-T-C...” biçiminde belirli bir dizi içeren bir gen bölgesi düşünelim. Bu dizinin karşılığı olacak şekilde tasarlanan rehber RNA, Cas proteinine bağlanır. RNA hedef DNA’ya tamamlayıcı biçimde tutunduğunda Cas proteini o bölgeye sabitlenir ve kesim için uygun konum oluşur. Rehber RNA hedef diziyi değiştirdiğinde aynı Cas proteini farklı bir DNA bölgesine yönlendirilebilir. Ancak hangi rehber dizisinin seçileceği ve hedef dışı etkilerin nasıl azaltılacağı, ayrı bir tasarım konusudur.

CRISPR ile hedef DNA’nın tanınması ve kesilmesi

Hedef DNA’nın tanınması, rehber RNA’daki dizinin DNA’nın bir bölümüyle tamamlayıcı biçimde eşleşmesine dayanır. Cas proteinine bağlı rehber RNA, hücre içindeki DNA üzerinde kendisine uyan diziyi arar. Uygun eşleşme bulunduğunda rehber RNA ile DNA arasında baz çiftleri oluşur ve Cas proteini hedef bölgeye yerleşir. Bu tanıma, CRISPR sisteminin rastgele bir DNA parçası yerine belirli bir diziyi hedeflemesinin temel nedenidir.

Tanımanın ardından Cas proteini DNA’nın iki zincirinde kesim oluşturabilir. Böylece hedef genin içinde veya yakınında çift zincirli bir DNA kırığı meydana gelir. Kırık, hücrenin doğal onarım sistemlerini devreye sokar ve genetik değişikliğin başlangıç noktası olur. Cas9 kullanan tip II sistemlerinde hedef tanımanın gerçekleşmesi için rehber RNA ile DNA eşleşmesinin yanı sıra hedefin yanında bulunan kısa bir DNA işaretinin de uygun olması gerekir; bu işaretin ayrıntılı tanınma ve kesim mekanizması ayrı bir konudur.

Örneğin bir genin belirli bir bölümünü etkisizleştirmek isteyen araştırmacı, o bölgeyle eşleşen bir rehber RNA’yı Cas proteiniyle birlikte hücreye ulaştırır. Rehber RNA hedef bölgeyi bulduğunda Cas proteini DNA’yı keser. Kesimin kendisi genin son durumunu tek başına belirlemez; değişikliğin nasıl ortaya çıkacağı, hücrenin kırık uçlarını nasıl onardığına bağlıdır. Bu nedenle CRISPR düzenlemesi, hedefi bulma ve kesme aşamasının ardından hücresel onarım aşamasını da içerir.

DNA kırığının hücresel onarımla genetik değişikliğe dönüşmesi

Cas proteininin oluşturduğu DNA kırığı, hücre tarafından onarılması gereken bir hasar olarak algılanır. Hücre kırık DNA uçlarını yeniden birleştirirken dizide birkaç bazın eklenmesi, çıkarılması veya değiştirilmesi mümkündür. Bu küçük değişiklikler genin okuma düzenini bozarsa ilgili genin ürettiği protein azalabilir ya da işlevini kaybedebilir. Böylece CRISPR’ın oluşturduğu fiziksel kesim, hücresel onarım sonucunda kalıcı bir genetik değişikliğe dönüşür.

Bazı uygulamalarda hücreye hedef bölgeyle uyumlu bir DNA şablonu da sağlanabilir. Hücre bu şablondan yararlanırsa hedef bölgede daha önceden planlanan bir dizi değişikliği ortaya çıkabilir. Örneğin bir genin içindeki birkaç bazın çıkarılması, proteinin üretilememesine ve gen işlevinin incelenmesine yol açabilir; başka bir durumda hedef bölgeye yeni bir dizi eklenmesi amaçlanabilir. Onarımın NHEJ ve HDR olarak adlandırılan ayrıntılı yolları ile bu yolların nasıl kullanıldığı ayrı bir konudur.

Kullanım alanları ve teknolojinin kısa sınırları

CRISPR; temel biyoloji araştırmalarında gen işlevlerini incelemek, biyoteknolojik ürün geliştirmek ve hastalıklarla ilgili genetik çalışmaları desteklemek için kullanılır. CRISPR-Cas9 dışındaki sistemler de farklı Cas proteinleri ve hedef moleküller kullanabilen CRISPR sınıfları olarak kısaca anılabilir. Etik ve biyogüvenlik boyutu, gen düzenlemenin hangi hücrelerde ve hangi amaçlarla uygulanabileceğiyle ilgili değerlendirmeleri kapsar.

Hedef dışı kesim ve düzenleme doğruluğu

Rehber RNA hedef DNA’ya yeterince benzemeyen başka bir bölgeye de bağlanırsa hedef dışı kesim veya istenmeyen düzenleme meydana gelebilir. Bu nedenle CRISPR sonuçları her zaman tamamen kesin kabul edilmez; hedef dizinin seçimi ve düzenleme doğruluğunun değerlendirilmesi ayrı bir çalışma alanıdır.