PCR Nedir? Temel Bileşenleri, Aşamaları ve Kullanım Alanları

PCR’ın tanımı ve temel amacı

PCR’ın temel amacı, karmaşık bir DNA örneğinin içindeki belirli bir diziyi seçerek çoğaltmaktır. Böylece örnekte çok az miktarda bulunan hedef bölge, incelenebilecek kadar çok kopyaya dönüştürülür. Yöntem, DNA’nın iki zincirli yapısının ısıyla ayrılmasına, kısa DNA parçalarının hedef bölgeye bağlanmasına ve bir polimeraz enziminin yeni zincirler üretmesine dayanır.

PCR bir sıcaklık döngüsü yöntemidir. Isıtma, DNA zincirlerini birbirinden ayırır; sıcaklık düşürüldüğünde primerler kendi tamamlayıcı dizilerine bağlanır; ardından polimeraz, serbest nükleotitleri kullanarak bu primerlerin uçlarından yeni DNA zincirleri oluşturur. Yeni oluşan zincirler sonraki döngülerde kalıp olarak kullanılabildiği için hedef bölge her döngüde yeniden üretilir.

Örneğin adli incelemede örnek üzerinde yalnızca çok küçük bir DNA izi bulunabilir. PCR, bütün genomu rastgele çoğaltmak yerine primerlerin seçtiği belirli DNA bölgelerini artırarak bu izdeki genetik özelliklerin incelenmesine yardımcı olur. Benzer biçimde, bir mikroorganizmaya ait hedef DNA dizisinin aranması da yöntemin seçici çoğaltma mantığıyla yapılabilir.

PCR reaksiyonunun temel bileşenleri

Bir PCR karışımında ilk olarak DNA kalıbı bulunur. Kalıp DNA, çoğaltılmak istenen diziyi içeren örnektir. Bu örnekten iki farklı primerin bağlanacağı bölgeler ve bu bölgelerin arasında kalan hedef parça seçilir. Primerler, hedef DNA’daki belirli dizilere tamamlayıcı olacak biçimde tasarlanan kısa ve tek zincirli DNA parçalarıdır; hangi bölgenin çoğaltılacağını büyük ölçüde onların dizisi ve konumu belirler.

Reaksiyonun bir diğer temel unsuru ısıya dayanıklı DNA polimerazıdır. Bu enzim, yüksek sıcaklıkta DNA zincirlerinin ayrıldığı aşamadan sonra etkinliğini korur ve yeni zinciri sentezler. Isıya dayanıklı bir polimeraz kullanılmasının nedeni, enzimin her sıcaklık döngüsünde yeniden eklenmesine gerek bırakmamasıdır. Taq polimeraz, bu amaçla kullanılan ısıya dayanıklı polimerazlara bir örnektir.

Yeni DNA zincirlerinin yapı taşları serbest nükleotitlerdir. Polimeraz, kalıp zincirdeki bazların tamamlayıcılarına uygun nükleotitleri sırayla ekler. Ayrıca enzim etkinliğini ve DNA’nın uygun biçimde eşleşmesini sağlayan tampon çözelti gerekir. Tampon koşulları; tuzlar, iki değerlikli iyonlar ve nükleotitlerle birlikte reaksiyonun verimliliğini etkiler.

Primerlerin hedef DNA’yı belirlemesi, PCR’ın özgüllüğünün temelidir. İki primer, hedef bölgenin iki ucuna karşılık gelen tamamlayıcı dizilere bağlanır ve sentez bu bölgelerden başlayarak aradaki parçaya doğru ilerler. Primer dizisi hedefle yeterince eşleşmezse bağlanma gerçekleşmeyebilir; uygun olmayan koşullarda ise hedef dışı bölgelere bağlanma görülebilir. Örneğin bir patojene ait belirli bir DNA dizisini arayan çalışmada, primerler o patojene özgü bölgelerin iki yanına tasarlanır; böylece çoğalan ana ürün, bu iki bölge arasında kalan dizidir.

PCR döngüsünün üç aşaması

PCR’ın temel döngüsü denatürasyon, primerlerin bağlanması ve uzama olmak üzere üç aşamadan oluşur. Her aşamada sıcaklık değiştirilerek DNA’nın farklı işlemler için uygun hale gelmesi sağlanır. Bu üç aşamanın art arda tekrarlanması, hedef dizinin kopyalanma sürecini oluşturur.

Denatürasyon aşamasında karışım yüksek sıcaklığa çıkarılır. DNA’nın iki zincirini bir arada tutan bağlar zayıflar ve çift zincirli DNA iki tek zincire ayrılır. Böylece her zincir, yeni bir DNA zinciri üretimi için okunabilir kalıp haline gelir. Örneğin başlangıçtaki çift zincirli hedef DNA, bu aşamanın sonunda polimerazın erişebileceği iki ayrı kalıp zincir sunar.

İkinci aşama, primerlerin bağlanmasıdır. Sıcaklık denatürasyona göre düşürülür ve primerler, dizileriyle tamamlayıcı olan tek zincirli DNA bölgelerine tutunur. İki primerden biri bir zincirde, diğeri karşı zincirde hedef bölgenin diğer ucunda görev yapar. Bağlanma sıcaklığı primerlerin özelliklerine göre seçilir: sıcaklık çok düşük olursa kusurlu eşleşmeler, çok yüksek olursa yetersiz bağlanma görülebilir.

Uzama aşamasında DNA polimeraz primerin serbest ucundan başlayarak yeni zinciri sentezler. Enzim, kalıp DNA’daki bazın karşısına uygun nükleotidi ekler ve hedef bölgenin tamamlayıcı kopyasını oluşturur. Bu aşamanın süresi, kullanılan enzime ve çoğaltılacak parçanın uzunluğuna bağlıdır. Örneğin primerler bir DNA parçasının iki ucunu belirlemişse, polimeraz her iki kalıp üzerinde bu sınırlar boyunca ilerleyerek aynı hedef bölgenin yeni kopyalarını meydana getirir.

Bu üç aşama tek bir termal döngüdür. Uygulamada çok sayıda döngü art arda yürütülür; döngülerin öncesinde enzimi etkinleştirmek için bir başlangıç ısıtması, sonrasında ise tamamlanmamış zincirleri tamamlamaya yönelik ek bir adım bulunabilir. Bunlar temel üç aşamadan ayrı yardımcı adımlardır.

Döngülerin hedef DNA miktarını artırması

Her döngüde denatürasyonla açılan DNA zincirleri primerler için kalıp olur. Primerler bağlandıktan sonra polimeraz yeni tamamlayıcı zincirleri üretir. Oluşan bu yeni zincirler de sonraki döngüde kalıp olarak kullanılabildiğinden, çoğaltma yalnızca başlangıçtaki DNA molekülleriyle sınırlı kalmaz.

Bu mekanizma PCR’ın küçük miktardaki başlangıç DNA’sına karşı duyarlı olmasını açıklar. Hedef bölgeyi çevreleyen primerler doğru seçilmişse, her yeni döngü aynı bölgenin kopyalarını üretmeye devam eder. Sonuçta başlangıç örneğinin tamamı değil, primerlerin sınırlandırdığı belirli DNA parçası baskın biçimde çoğaltılır. Bu nedenle PCR, az miktardaki adli DNA izi veya örnekteki hedef bir mikroorganizmanın dizisi gibi materyallerin incelenmesinde kullanılabilir.

PCR ürününün ve temel kullanım alanlarının yorumlanması

PCR sonunda oluşan çoğaltılmış hedef DNA parçasına amplikon ya da PCR ürünü denir. Ürünün elde edilmesi, kullanılan primerlerin seçtiği hedef bölgeye karşılık gelen bir DNA parçasının reaksiyonda üretildiğini gösterir; ürünün anlamı, deneyin amacı ve kullanılan kontrollerle birlikte değerlendirilir. PCR ürünü çoğu zaman daha ileri bir genetik incelemenin materyali olur.

Ürün, agaroz jel elektroforeziyle de incelenebilir. Bu yöntemde DNA parçaları boyutlarına göre ayrılır ve sonuç, bilinen uzunlukta parçalar içeren DNA merdiveniyle karşılaştırılır. Beklenen boyuta yakın bir bant görülmesi, hedeflenen uzunlukta bir ürün oluştuğunu kontrol etmeye yardımcı olur.

PCR; genetik araştırmalarda belirli dizilerin incelenmesi, DNA klonlama ve dizileme öncesi çoğaltma, eski DNA örneklerinin analizi, adli DNA profilleme ve enfeksiyon etkenlerine ait nükleik asit dizilerinin aranması gibi alanlarda kullanılır. Enfeksiyon incelemelerinde hedefe özgü primerler, etkenin DNA’sındaki seçilmiş diziyi çoğaltır. Böylece kültürde üretilmesi zor veya yavaş gelişen bazı etkenlerin genetik izleri araştırılabilir.

PCR’nin RT-PCR ve qPCR gibi farklı uygulamaları da vardır; bunlar başlangıç materyali veya ölçüm biçimi bakımından klasik PCR’dan ayrılan yaklaşımlardır.

PCR’ın temel sınırlılıkları ve kontaminasyon duyarlılığı

PCR için hedef dizinin en azından primer tasarımına yetecek kadar bilinmesi gerekir; uygun olmayan primerler hedef dışı ürünlere veya yetersiz çoğaltmaya yol açabilir. Çok küçük miktardaki yabancı DNA bile çoğaltılabildiği için kontaminasyon yanlış pozitif ya da yanıltıcı sonuç oluşturabilir; ayrıca başlangıç örneğinin niteliği reaksiyonu engelleyebilir. PCR optimizasyonu ve ayrıntılı hata analizi ayrı bir çalışma alanıdır.