Spektrofotometri: Çalışma İlkesi, Absorbans ve Konsantrasyon Hesabı

Spektrofotometrinin temel çalışma ilkesi

Bir spektrofotometre, seçilmiş bir dalga boyundaki ışığın örneğe gönderilmesinden önceki ve örnekten çıktıktan sonraki şiddetini karşılaştırır. Örneğe ulaşan ışığın bir bölümü moleküller tarafından soğurulur; kalan bölüm ise örnekten geçer veya bazı ölçüm düzeneklerinde yansır. Cihaz, bu ışık şiddetleri arasındaki farkı doğrudan bir konsantrasyon değeri olarak ölçmez. Önce ışık şiddetlerini geçirgenlik ya da absorbans biçiminde ifade eder; konsantrasyon ise uygun bir yasa veya kalibrasyon ilişkisi kullanılarak yorumlanır.

Soğurma, moleküllerin sahip olduğu enerji düzeyleriyle ışığın enerjisinin uyuşmasına bağlıdır. Bir molekül yalnızca belirli enerjiye, dolayısıyla belirli dalga boylarına karşılık gelen ışığı daha güçlü soğurabilir. Bu nedenle aynı örneğin farklı dalga boylarında ölçülen absorbansları aynı olmak zorunda değildir. Örneğin renkli bir bileşik görünür bölgede ışığı soğuruyorsa, o bileşiğin çözeltisinden geçen ışık şiddeti bileşiğin miktarı arttıkça azalır. Cihaz bu azalmayı ölçerek bilinmeyen örneğin standartlarla veya Beer-Lambert yasasıyla karşılaştırılmasına olanak verir.

Bir örneğin dalga boyu taraması yapıldığında absorbansın yüksek olduğu bölgeler belirlenebilir. Bu spektral bilgi, maddenin hangi ışığı daha güçlü soğurduğunu gösterir; tek başına her zaman miktar bilgisini vermez. Miktar tayini için ölçüm koşulları sabit tutulmalı ve sinyal ile konsantrasyon arasındaki ilişki kurulmalıdır.

Geçirgenlik ve absorbans

Geçirgenlik, örnekten geçen ışık şiddetinin örneğe gelen ışık şiddetine oranıdır. I0 örneğe gelen, I ise örnekten çıkan ışık şiddetini gösterirse geçirgenlik T = I / I0 olarak yazılır. Yüzde geçirgenlik ise %T = 100T biçimindedir. Örnek ışığın çoğunu geçiriyorsa T yüksek, büyük bölümünü soğuruyorsa T düşük olur.

Absorbans, ışığın örnek tarafından soğurulmasını logaritmik olarak ifade eder ve geçirgenlikle şu şekilde ilişkilidir: A = -log T. Yüzde geçirgenlik kullanılıyorsa A = -log(%T / 100) yazılır. Bu nedenle %T ile absorbans doğrusal bir ilişki içinde değildir. Örneğin %T = 100 olduğunda absorbans sıfırdır; %T azaldıkça absorbans artar. Aynı örnekte ışık yolu veya madde miktarı arttığında geçen ışık azalabileceği için geçirgenlik düşer ve absorbans yükselir.

Örneğin bir çözeltinin %T değeri 25 ise T = 0,25 olur ve absorbans A = -log(0,25) yaklaşık 0,60 bulunur. Başka bir çözeltinin %T değeri 50 olduğunda absorbans yaklaşık 0,30'dur. Bu iki örnekte daha düşük geçirgenlik değerine sahip olan çözeltinin absorbansı daha büyüktür. Konsantrasyon hesabında genellikle absorbans tercih edilir; çünkü uygun koşullarda absorbans konsantrasyonla doğrusal ilişki kurar.

Beer-Lambert yasası ve geçerlilik koşulları

Beer-Lambert yasası, bir çözeltinin absorbansını ışığı soğuran türün konsantrasyonu ve ışığın örnek içinde aldığı yol ile ilişkilendirir. Yasanın temel ifadesi A = εbc şeklindedir. Burada A absorbans, ε molar soğurma katsayısı, b ışık yolu uzunluğu ve c ise ışığı soğuran türün molar konsantrasyonudur (mol/L). Belirli bir madde, dalga boyu ve küvet yolu için ε ile b sabit olduğunda absorbans konsantrasyonla doğru orantılıdır.

Bu ilişki, ışığın örnekte ilerlerken soğurucu moleküllerle karşılaşmasıyla açıklanır. Konsantrasyon arttığında ışığı soğurabilecek molekül sayısı ve ışığın soğurulma olasılığı artar. Işık yolu uzadığında da ışın daha fazla soğurucu ortamdan geçtiği için absorbans yükselir. Örneğin aynı küvette ölçülen ve yalnızca konsantrasyonları farklı olan iki çözelti için birinin konsantrasyonu iki katına çıkarıldığında, uygun doğrusal aralıkta absorbansı da yaklaşık iki katına çıkar.

Yasa, ölçüm ışığının yeterince dar bir dalga boyu aralığında seçildiği, çözeltinin homojen ve berrak olduğu, soğurucu türün ölçüm sırasında kimyasal biçimini önemli ölçüde değiştirmediği ve ölçümün doğrusal aralıkta yapıldığı durumlarda kullanılmalıdır. Seyreltik çözeltiler genellikle bu yaklaşım için daha uygundur. Saçılma, bulanıklık, floresans, yüksek konsantrasyon veya kimyasal dengenin değişmesi ölçülen sinyalin yalnızca hedef bileşiğin soğurmasından kaynaklanmamasına yol açabilir.

Bir örneğin absorbansı 0,40 ve aynı koşullardaki standart çözeltinin absorbansı 0,20 ise, doğrusal Beer-Lambert koşulları altında örneğin konsantrasyonu standardın yaklaşık iki katı olarak yorumlanabilir. Ancak bu yorum, iki ölçümde dalga boyu, küvet yolu, blank ve diğer ölçüm koşullarının aynı olmasına bağlıdır. Beer-Lambert yasasından sapmaların ayrıntılı analizi ayrı bir konudur.

Spektrofotometrenin temel bileşenleri ve ölçüm süreci

Temel bir spektrofotometrede ışık kaynağı, dalga boyu seçici optik sistem, örnek bölmesi, küvet ve dedektör bulunur. Işık kaynağı ölçüm bölgesini kapsayan ışını üretir. Dalga boyu seçici sistem, geniş bir ışık aralığından ölçüm için gereken dar aralığı ayırır; bu işlem hareketli bir kırınım ağı ve yarıkla taramalı biçimde ya da bir dedektör dizisiyle birden çok dalga boyu birlikte kullanılarak yapılabilir. Küvet, örneği ışık yoluna sabit bir geometriyle yerleştirir. Dedektör ise örnekten geçen ışığı algılar ve ışık şiddetiyle ilişkili elektriksel sinyal üretir.

Ölçüm başlamadan önce referans olarak kullanılacak blank ile temel sinyal ayarlanır. Ardından örnek küvete konur ve seçilen dalga boyunda dedektöre ulaşan ışık ölçülür. Elektronik sistem, örnek sinyalini referans sinyaliyle karşılaştırarak geçirgenlik veya absorbans değerini hesaplar. Tek ışınlı cihazlarda ışık şiddeti örnek yerleştirilmeden önce ve sonra karşılaştırılır; çift ışınlı cihazlarda referans ve örnek yollarından gelen sinyaller karşılaştırılır. Cihaz türleri arasındaki optik ayrıntılar ve ileri tasarım özellikleri başka bir konunun kapsamındadır.

Dalga boyu seçimi, λmax, blank ve küvet kullanımı

Dalga boyu seçimi, ölçümün duyarlılığını ve seçiciliğini etkiler. Bir maddenin absorbansının en yüksek olduğu dalga boyu λmax olarak adlandırılır. Miktar tayininde çoğu zaman λmax civarında çalışmak, küçük konsantrasyon değişimlerinin daha belirgin bir absorbans değişimi oluşturmasına yardımcı olur. Bununla birlikte örnekteki başka türlerin aynı bölgede soğurma yapıp yapmadığı ve cihazın ölçüm aralığı da dikkate alınmalıdır.

Blank, hedef analiti içermeyen ancak çözücü ve ölçüm ortamının diğer bileşenlerini içeren referans çözeltidir. Blank ölçümü, çözücünün, küvetin ve cihazın temel sinyalinin örnek sinyalinden ayrılmasına yardım eder. Örneğin renk oluşturan bir tepkimeyle ölçüm yapılıyorsa blank, renk oluşturan analit yerine tepkime ortamını temsil etmelidir. Yanlış blank kullanılırsa cihaz, örneğe ait olmayan soğurmayı hedef bileşiğe aitmiş gibi değerlendirebilir.

Küvetin optik özellikleri dalga boyu bölgesine uygun olmalıdır. Görünür bölge ölçümlerinde cam veya plastik küvetler kullanılabilirken, morötesi bölgedeki ölçümlerde ışığı soğurmayan kuvars küvet gerekir. Küvetin ışık geçen yüzeyindeki parmak izi, çizik, damla veya kabarcık dedektöre ulaşan ışığı değiştirir. Bu nedenle küvet aynı yönde yerleştirilmeli, dış yüzeyi temiz tutulmalı ve örnek ışık yolunu tamamen dolduracak biçimde kullanılmalıdır. Spektrofotometrik yöntemlerde ayrıntılı numune hazırlama ve uygulama protokolleri ayrı bir konudur.

Kalibrasyon eğrisi ve konsantrasyon hesabı

Kalibrasyon eğrisi, konsantrasyonu bilinen standart çözeltilerin absorbanslarının aynı ölçüm koşullarında belirlenmesiyle oluşturulur. Yatay eksene standart konsantrasyonları, dikey eksene absorbansları koyarak elde edilen ilişki incelenir. Beer-Lambert yasasının geçerli olduğu aralıkta noktalar yaklaşık doğru üzerinde bulunur. Bu doğrunun denklemi genellikle A = mc + b biçiminde yazılır; burada m eğim, b kesim noktası, c konsantrasyon ve A absorbans değeridir.

Bilinmeyen örneğin absorbansı ölçüldükten sonra bu değer kalibrasyon denkleminde yerine konur. Böylece bilinmeyen konsantrasyon c = (A - b) / m bağıntısıyla hesaplanır. Hesaplamada bilinmeyen örneğin absorbansı standartların oluşturduğu doğrusal aralıkta olmalıdır. Absorbans bu aralığın dışındaysa örnek uygun bir seyreltmeyle yeniden ölçülmeli ve bulunan sonuç seyreltme katsayısıyla düzeltilmelidir.

Örneğin standartlardan elde edilen kalibrasyon denklemi A = 0,050c + 0,010 olsun. Konsantrasyon birimi mg/L ve bilinmeyen örneğin absorbansı 0,260 ise c = (0,260 - 0,010) / 0,050 = 5,0 mg/L bulunur. Eğer bu bilinmeyen örnek ölçümden önce iki kat seyreltilmişse başlangıç örneğinin konsantrasyonu 10,0 mg/L olarak hesaplanır. Bu örnekte sonuç, yalnızca ölçülen absorbans kalibrasyon doğrusunun geçerli aralığındaysa anlamlıdır.

Kalibrasyon sırasında blank ile sıfır noktası belirlenir ve standartlar ile bilinmeyen örnek aynı dalga boyu, küvet yolu ve ölçüm koşullarında çalışılır. Doğrunun kesim noktasının sıfırdan belirgin biçimde farklı olması, blank veya sistematik ölçüm etkilerinin incelenmesini gerektirebilir. Kalibrasyon eğrisinin uygunluğu ve yöntem performans parametrelerinin ayrıntılı değerlendirilmesi ayrı bir konudur.

Ölçüm hataları ve sonuçların güvenilirliği

Güvenilir bir spektrofotometrik sonuç için ölçülen absorbansın yalnızca hedef bileşiğin soğurmasını temsil etmesi gerekir. Bulanık örneklerde ışık saçılması absorbansı olduğundan yüksek gösterebilir. Kirli, çizilmiş veya yüzeyinde kabarcık bulunan küvetler de dedektöre ulaşan ışığı değiştirir. Küvetin farklı yönlerde yerleştirilmesi, örnek hacminin ışık yolunu yeterince doldurmaması ve yanlış blank kullanılması tekrarlanabilirliği ve doğruluğu bozabilir.

Örnek absorbansının kalibrasyon eğrisinin doğrusal aralığı dışında kalması da önemli bir sorundur. Çok yüksek absorbanslarda dedektöre ulaşan ışık çok azalabilir; bu durumda küçük sinyal değişimleri büyük hesaplama etkileri oluşturabilir. Böyle bir örnek doğrudan yorumlanmak yerine uygun biçimde seyreltilerek yeniden ölçülmelidir. Ölçüm boyunca dalga boyu, küvet yolu, blank ve sıcaklık gibi etkili koşulların sabit tutulması; standartların ve bilinmeyen örneğin aynı yöntemle çalışılması sonucu daha güvenilir kılar.

Sonucun güvenilirliği yalnızca tek bir absorbans değerine bakılarak değerlendirilmez. Standartların doğru sıralanması, kalibrasyon noktalarının doğrusal davranışı, blank değerinin uygunluğu ve tekrarlı ölçümlerin birbiriyle uyumu birlikte incelenmelidir. Beer-Lambert yasasından sapmaların ayrıntılı nedenleri ve yöntem validasyonuna ait performans parametreleri bu yazının kapsamı dışındadır.

Spektrofotometrinin kullanım alanları

Spektrofotometri; kimya, biyokimya, moleküler biyoloji, malzeme bilimi ve baskı-renk endüstrisi gibi alanlarda kullanılır. Protein, nükleik asit ve enzim çalışmalarında miktar tayini veya tepkime izleme yapılabilir; baskı ve tekstil uygulamalarında ise renk ölçümleri ürünlerin karşılaştırılmasına yardımcı olur. Analitik kimyadaki yeri ve farklı uygulama alanları ayrıca ele alınabilir.